撰文︱陈圆圆，李倩，赵新锋

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种发病隐匿、病程不可逆转的神经退行性疾病，由德国科学家Alois Alzheime于1906年首次发现并报道。AD的发病机制异常复杂，其病因迄今不明，临床上现有的药物仅能短期缓解症状，无法治愈疾病[1]。因其致残率高、治疗难度大等特点给患者家庭及社会带来了沉重的精神负担。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体在突触的空间分布不同，其生物学效应也随之发生改变：突触内NMDA受体的激活具有神经保护作用，而突触外NMDA受体的激活则诱导神经元死亡[2]。NMDA-2A主要存在于突触内而少见于突触外，其激活可以促进神经元的存活而避免突触外NMDA受体诱导的兴奋毒性[3]。实际上，Hanson及其同事已经在2020年报道了NMDA-2A受体在认知功能障碍中的保护作用[4]，然而目前对NMDA受体的研究仍以拮抗剂为主，缺乏亚型特异性和突触特异性。

2023年1月27日，西北大学生命科学学院赵新锋课题组在国际学术期刊CNS Neuroscience & Therapeutics上发表了题为“N-methyl-D-aspartic acid receptor 2A functionalized stationary phase: A reliable method for pursuing potential ligands against Alzheimer's disease from natural products”的文章，该研究以NMDA-2A受体为靶点，基于EGFR-tag与其底物ibrutinib之间的特异性共价反应，将NMDA-2A受体从细胞裂解液中一步固定化于氨基微球表面，制备了NMDA-2A受体色谱固定相，为中药及天然产物中作用于NMDA-2A受体的活性配体的快速筛选提供了新思路。（拓展阅读：赵新锋课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：iScience｜西北大学赵新锋/李倩团队建立血管紧张素II受体1型受体（AT1R）双位点固定化方法并用于非激动活性配体筛选）

作者采用大肠杆菌表达重组EGFR-NMDA-2A，将ibrutinib修饰至氨基微球表面，基于EGFR与其底物ibrutinib之间的特异性共价反应，将NMDA-2A受体直接从细胞裂解液中一步固定化至微球表面，制备受体色谱固定相，合成路线图如图1所示。

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，作者发现，0.5 mM IPTG/24 h/37 ℃是NMDA-2A受体在大肠杆菌中最佳的表达条件（图2A）；NMDA-2A受体主要存在于细胞裂解液的上清中，而在沉淀中则几乎检测不到（图2B）。因此，作者采用细胞裂解液的上清用来制备NMDA-2A受体色谱固定相。

为了探究NMDA-2A受体是否已经固定化至微球表面，作者采用了扫描电子显微镜和X射线光电子能谱技术对NMDA-2A受体色谱固定相进行了表征。如图3A-C所示，ibrutinib修饰后的氨基微球几乎未发生任何变化，而当NMDA-2A受体修饰后则明显变得粗糙。此外，微球中C元素的相对含量随着ibrutinib、NMDA-2A受体的修饰而逐渐降低，而N、O元素的相对含量则随着ibrutinib、NMDA-2A受体的修饰逐渐升高，说明NMDA-2A已成功固定于微球表面（图3D-G）。

作者进一步查验了NMDA-2A受体色谱柱在识别配体方面的特异性和稳定性。如图4A所示，比索洛尔和艾司洛尔（β-肾上腺素受体药物）在NMDA-2A受体色谱柱上的保留时间分别为1.62 min和2.31 min，与亚硝酸钠测出来的系统死时间（1.58 min）非常相近；而NMDA受体药物—硫酸奎尼丁和盐酸多奈哌齐在NMDA-2A受体色谱柱上的保留时间分别为10.25 min、19.67 min，明显长于系统死时间，说明NMDA-2A受体色谱柱可以根据药物在柱子上的保留时间特异性识别其配体。此外，硫酸奎尼丁、盐酸多奈哌齐的色谱图在30天内重复性良好，证明NMDA-2A受体色谱柱至少在30天内保持稳定，为中药活性成分的筛选提供了可能（图4B-C）。

在此基础上，作者采用NMDA-2A受体色谱柱对栀子提取液进行了筛选，收集的保留成分经质谱鉴定为藏红花酸。通过MTT实验和形态学观察，作者发现藏红花酸在低于40 μM时不会影响细胞活性和形态，但其浓度增大到80 μM时则会产生明显的细胞毒性。因此，他们选择0.6 μM、2.5 μM、10 μM和40 μM的藏红花酸进行后续的实验。Western blot实验表明，AD模型组中NMDA-2A蛋白水平明显低于正常对照组，进一步用藏红花酸处理后，NMDA-2A蛋白水平以藏红花酸浓度依赖性方式增加，提示藏红花酸或可通过调控NMDA-2A受体发挥抗AD作用，也从细胞水平验证了NMDA-2A受体色谱柱的可靠性。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者聚焦NMDA-2A受体，基于EGFR-tag与其底物ibrutinib之间的特异性共价反应，将带有EGFR标签的NMDA-2A受体直接从细胞裂解液中捕获至ibrutinib修饰的微球表面，建立了一种NMDA-2A受体活性配体筛选新方法。该方法由于避免了复杂的蛋白质分离纯化过程，最大程度上保持了受体活性，具有分析速度快、特异性强、稳定性好等优点，不仅可以快速识别中药中的功效成分，还可以明确药物的作用靶点，为中药及天然产物中靶向NMDA-2A受体的活性配体筛选提供了方法学借鉴，也是对传统的药物发现策略的有利补充。不足的是，基于NMDA-2A受体建立的受体色谱技术只是体外的筛选手段，不能完全模拟人体内的复杂环境。此外，该研究仅将栀子中与NMDA-2A受体结合的成分筛选出来，并在细胞水平进行了验证，但藏红花酸对NMDA-2A受体的具体调控机制还需进一步阐明。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cns.14101

第一作者和通讯作者简介

赵新锋，教授，博士生导师，西北大学中药学/药学学科带头人，中国中医药信息学会科技创新与成果转化分会的常务理事，中国药学会药物分析专业委员会委员，陕西省药学会理事，《Chinese Medicine》等杂志编委。主要致力于受体色谱的创建研究和应用研究。主持国家自然科学基金项目及其他省部级重大科研项目20余项；在Science等国际权威期刊发表学术论文70余篇；获中国发明专利授权6项，出版专著1部，软件著作权1项；西部药学之星、陕西省中青年科技创新领军人才。

陈圆圆，西北大学中药学专业在读博士研究生。围绕阿尔茨海默病双靶点色谱模型的建立及评价开展系列研究，国际期刊Cell Mol Life Sci (IF = 9.207)审稿人，以第一作者在Free Radic Biol Med、CNS Neurosci Ther和Biomark Res等期刊发表SCI论文6篇。

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参考文献

[1] Chen YY, Wang MC, Wang YN, et al. Redox signaling and Alzheimer's disease: from pathomechanism insights to biomarker discovery and therapy strategy. Biomark Res. 2020;8:42.

[2] Hardingham GE, Bading H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci. 2010;11(10):682-696.

[3] McQuail JA, Beas BS, Kelly KB, et al. NR2A-containing NMDARs in the prefrontal cortex are required for working memory and associated with age-related cognitive decline. J Neurosci. 2016;36(50):12537-12548.

[4] Hanson JE, Ma K, Elstrott J, et al. GluN2A NMDA receptor enhancement improves brain oscillations, synchrony, and cognitive functions in dravet syndrome and Alzheimer's disease models. Cell Rep. 2020;30(2):381-396.e4

本文完